Las enseñanzas de errar

Hola a todos:

¡Vaya con la última jornada!

Como pudisteis comprobar, todo estuvo bien planificado: los cultivos, las placas, los extendidos...  Nada menos que 36 placas en tres horas. Pero, como no podía ser de otra forma, surgieron los conocidos como imponderables (leyes de Murphy...).

i. Imponderable nº 1. El primero, los cultivos no llegaron a nuestro ansiado 0,5. Pero tras pensar un poco, lo pudimos resolver.

ii. Imponderable nº2. Después todo tenía que estar bien organizado y bien rotulado, y a pesar de ello, nos equivocamos en la rotulación. Esto implicaba errar sobre las placas de sacaras y las de Km. Equivocación grave que pudimos corregir. Y por último,

iii. Imponderable nº 3. En los plaqueos hubo también algunos errores (volúmenes, diluciones...) que afortunadamente pudimos también detectar y corregir.

Aquí tenemos un resumen de la asignación numérica e identificación de los grupos de placas. Os recuerdo que cada cultivo dio lugar a 4 placas. Las diluciones 0 y -1 para las de Sac y las diluciones -5 y -6 para las de Km.

(i) Placas 1: 3G; Placas 3: 3G; Placas 4: 3G.

(ii) Placas 5: 1F; Placas 6: 1F; Placas 7:1F.

(iii) Placas 9: 1H; Placas 10: 1H; Placas 11: 1H.

No hay nada como equivocarse para comprender lo que estamos haciendo ¿Verdad?

Ya nos estamos dando cuenta de realizar los experimentos casi perfectos... Si esperamos una respuesta de ellos, la respuesta que siempre debemos evitar es la de tener que repetirlo. 

Nos queda una espera ansiosa en la que nos dé el pistoletazo de salida, las placas de casa de Laura. Las bacterias ya están a 28ºC ¡o eso creo!

La próxima sesión es el jueves 5 de marzo. Ese día analizaremos los resultados de estos crecimientos. ¿Podremos aguantar?

¡Esta vez debemos estar todos!

¡¡¡Aupa 2º team!!!

Dr Francisco Martínez-Abarca

Estación Experimental del Zaidín - CSIC

Department of Microbiology

Consecuencias del "brain storming"

Hola a todos; respiremos tras la última sesión... Uffff.

Cuando creíamos que quedaba poco para resolver nuestra famosa pregunta ¿Dónde mutan (más) los genes?, vemos que estamos casi como al principio, ¿o no?

Recapitulemos:

Hemos comprendido que la resistencia a sacarosa viene, o debe venir, de una mutación en el gen SacB. Como todo el mundo sabe, el producto de este gen se corresponde con una proteína de 50 kilodalton de Bacilus subtilis que codifica para una actividad: levansucrase (sucrose:2,6-P-D-fructan 6-3-D-fructosyltransferase; EC 2.4.1.10) [1]. Echad un vistazo a esta referencia, en concreto a lo señalado en amarillo. Y hemos observado, con nuestros propios ojos dos tipos de colonias en las placas de sacarosa (grandes y/o chicas). En ambas, el gen sacB debe estar mutado pues son resistentes a sacarosa. El problema es que las frecuencias de mutación cambian dependiendo de qué colonias consideremos.. ¿?.

Por lo tanto, hemos comprendido que para cuantificar bien la frecuencia de mutantes debemos de partir de cultivos (3G, 1F y 1H) en el mismo estado "mutagenizado", o sea que en el momento de la inoculación al cultivo líquido el 100% de las colonias sean SacS. Que es lo que hemos hecho al final de esta mañana.

El próximo jueves 26 de febrero a las 16:00 nos toca la tarea experimental de demostrar que lo hemos hecho adecuadamente.

Nuestro resultado debería ser definitivo, o lo que es lo mismo, debe de ser lo suficientemente claro para llegar a una conclusión: ¿dónde mutan más los genes? Arriba, abajo, en medio o en todas partes por igual....

[1] Gay p, Le Coq D, Steinmetz M, Berkelman T, Kado CI. (1985). Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elements in gram-negative bacteria. J Bacteriol. 164:918-921.

Aupa 2a team !!! Cualquier duda soy todo oídos (debe de haberlas !!!).

Dr. Francisco Martínez-Abarca

Estación Experimental del Zaidín - CSIC

Departament of Microbiology

El “curioso” fenotipo Sacarosa-R

Hola a todos:

En breve, el próximo lunes 23, tendremos una nueva sesión de nuestro proyecto. Os recomiendo que le echemos un vistazo amplio y "profundo" a lo realizado hasta ahora (mirad tanto el blog como en vuestras anotaciones).

Como sabéis (sabemos), el proyecto pretende determinar la frecuencia en la aparición de mutantes resistentes a la sacarosa de distintos aislados de la bacteria Sinorhizobium meliloti. Pero... ¿qué debemos de considerar como resistente a la sacarosa?

En la foto de una de las placas crecidas en Laura's Incubator podéis observar a o que me refiero. Se corresponde con una de las placas donde solo debían aflorar las colonias SacR.

Sin embargo, se pueden observar a grandes rasgos dos tipos: unas colonias de entre 0,5-1 mm de diámetro (grandes) y otras menores de 0,2 mm. ¿Cuáles son resistentes reales a sacarosa, o sea, SacR phenotype? ¿Solo las grandes o ambas?

Como véis, el criterio a elegir es clave a la hora de establecer una frecuencia y por tanto es clave a la hora de estimar el resultado.

Analizaremos la Numerología obtenida hasta ahora y comenzaremos un ensayo de "drop" que nos ayude a discernir las distintas opciones. ¡¡¡Mirad las entradas y correos previos!!!

Se me antoja que nuestra próxima sesión va a ser clave en nuestro proyecto. Os quiero con la mente despierta.

Francisco Martínez-Abarca
Estación Experimental del Zaidín. CSIC.
Departamento de Microbiología
Granada

Nuevos experimentos confirmatorios

Hoy hemos descubierto que Laura tiene una verdadera estufa profesional en casa. Las placas deben estar a 28-30º ¡Seguro!

¡Vaya fotos! ¡Y vaya crecimiento! A los cinco días ya estaban así. Nos va a venir bien tener esta nueva estufa, como no podía ser de otra forma.

Placa en casa de Laura

 

Placa en casa de Clara. El resto de las placas estaban parecidas

En lo que respecta a nuestro proyecto, ya nos vamos acercando a las preguntas concretas. Y en breve deberemos ya empezar con la escritura del trabajo. Sin prisa, pero sin pausa...

Como sabéis, en este nuevo experimento, aparte de repetir si la aparición de resistentes a sacarosa es menor en 3G que en 1H hemos incluido una nueva bacteria, la 1F, que como os comenté en esta sesión debería al menos da una frecuencia intermedia entre las otras dos.

Toca pensar un poco el porqué de esta suposición...

¿Seremos capaces de confirmar este resultado?

Os recuerdo. Hemos hecho duplos de cada pregunta (1F, 3G y 1H). Uno de los duplos se los llevó Laura a su casa (¡que tendrá que hacernos fotos para todos, ya que tiene la mejor estufa y parece ser que una cámara muy buena!). Los otros, como siempre y como medida de seguridad se han quedado en el laboratorio a 28ºC estándar.

La semana que viene nos toca contar colonias. Pero... ya sabemos que este proyecto no es solo contar colonias ¿o sí?

Francisco Martínez-Abarca

Departamento de Microbiología

Estación Experimental del Zaidín. CSIC

Granada

Nuestro primer resultado a la pregunta ¿dónde mutan (más) los genes?

En nuestra tercera sesión hemos empezado a descubrir que no estamos "simplemente" contando colonias, ¿verdad?

Empezamos a observar que los distintos fenotipos mostrados por las distintas bacterias (1H, 3G y la original RMO17) no son idénticos y que parecen tener una explicación. Empezamos a entender cómo se hacen los experimentos en Microbiología y qué tipo de respuestas dan. Por ejemplo: tiempos de generación, división celular, diluciones, conteos varios y test de sensibilidad/resistencia.

Por ahora, ya tenemos un primer resultado que deberemos de corroborar experimentalmente. Debemos pensar en repetir el experimento, añadir nuevos controles y comprobar si se confirma el patrón.

Pero... ¿de qué resultado estamos hablando?

En este esquema tenéis el procedimiento llevado a cabo para las diluciones seriadas.

De esta manera obtuvimos los siguientes datos para cada cultivo, os recuerdo.

Cultivo 3G: donde el gen SacB se encuentra arriba (cerca del origen de replicación).

Cultivo 1 H: donde el gen SacB se encuentra abajo (lejos del origen de replicación).

Estos datos nos llevan "de momento" a inferir la siguiente frecuencia de mutación para cada aislado:

Fmut3G: 96.3/(18.6 10⁷) = 5,177 10^-7

Fmut1H: 69.3/(7.85 10⁶) = 8,88 10^-6

Sin embargo hay varias razones que me inducen a pensar que debemos de confirmarlo:

1. Necesitamos inferir márgenes de error. Todo experimento se recomienda repetirlo al menos 3 veces…
2. Debemos de confirmar que los fenotipos son reales (cosa que ya estamos haciendo o no?)
3. Hay además un resultado “extraño”. ¿Quien lo comenta?? ¡¡¡ES IMPORTANTE!!!

¡¡¡Aupa 2A Team!!!   ¡¡¡Ya estamos en la senda correcta!!!!

 

Francisco Martínez-Abarca

Departamento de Microbiología.

Estación Experimental del Zaidín. CSIC.

Granada

Una noticia interesante

Hola a todos y feliz año.

El mundo de la investigación está unido y debe estar alerta ante nuevas noticias. Os propongo que leáis esta noticia publicada por El País y estudieis los paralelismos de lo que comenta con lo que estamos estudiando nosotros.
http://elpais.com/elpais/2014/12/31/ciencia/1420046780_149337.html

¿Realmente los hay? ¿En base a qué?

Cada vez que una célula se divide para generar otra, su ADN se copia y en este proceso suceden erratas que, acumuladas, explican gran parte de los tumores. ¿Podríamos extrapolar parte de nuestros resultados sobre estos estudios? Pensémoslo; siempre es importante comprender la posible relevancia de nuestros resultados.

Francisco Martínez-Abarca

Departamento de Microbiología

Estación Experimental del Zaidín

Granada

Nuestros primeros resultados

Hola a todos;

Tras la segunda sesión ya quedan atrás las primeras fantásticas impresiones... ¿o no? Sin embargo, ya empezamos a tener nuestros primeros resultados. Tras el conteo de colonias y la puesta en común de los datos observamos que ya podemos dar un valor a las bacterias presentes en una colonia. En caso de duda podéis consultar los correos anteriores.

Recapitulemos:

En vuestras libretas, tras el último día, debéis tener una tabla del conteo de las colonias de las placas semejante a esta que se incluye a continuación. Igualmente podéis acceder a imágenes de las placas a través de este enlace.

Esto nos ha permitido extrapolar los número de colonias contadas de manera que podamos estimar la cantidad de bacterias presentes en cada colonia como una media de, en algún caso, 4 valores.

Valores finales:

B:   14.7 x 10⁶

A: 20,96 x 10⁶

C: 6.015 x 10⁶

D: 0.831 x 10⁶

En otra ocasión hablaremos de los margenes de error y las desviaciones stándard. Entre vosotros ya hay gente familiarizada con estos parámetros estadísticos…
Debemos de recordar las operaciones que hicimos para obtener estos números. De nuevo, tenemos que calcular el número de generaciones que han transcurrido para la formación de cada una de las colonias; es decir,  ¿cuál es el numero de generaciones que han transcurrido para la colonia más grande y para la colonia más pequeña? Veréis como son bastante parecidos.
Y de estos valores surgen nuevas preguntas: ¿En cuántas generaciones ocuparían estas bacterias un volumen como el de la Tierra? ¿En cuánto tiempo? ¿Podríamos calcular de manera muy aproximada qué valor podríamos dar al volumen que ocupa una bacteria? ¿Ysu diámetro?

Premisas: Si imaginamos que cada colonia se corresponde con la mitad de una esfera cuyo diámetro en milímetros es el que aporta la tabla...¿En qué márgenes nos movemos en el calculo? Animémosnos, consultémoslo con nuestro entorno.Yo tan solo sé el valor que dicen los libros aceca del tamaño de S. meliloti, pero nunca he hecho este cálculo. En cualquier caso, soy todo oídos a posibles dudas o aclaraciones.

Por otro lado, nos esperan los resultados de un nuevo experimento (sobre el 9 de Enero o así). Hemos plaqueado dos cultivos (3G y 1H) partiendo de 1 x 10⁸ bacterias por mililitro sobre placas conteniendo el antibiótico kanamicina (Km) y placas conteniendo Km y sacarosa al 10%. Las diluciones han sido distintas pues esperamos obtener un mayor numero de colonias totales (resistente a Km) que mutantes (resistentes a sacarosa). En paralelo hemos puesto placas con la bacteria parental (RMO17).
Pregunta: ¿Qué esperamos ver en las placas con sacarosa en relación a esta bacteria control? O en otras palabras, ¿esta bacteria será sensible o resistente a sacarosa? (Podéis encontrar algunas pistas en la presentacion del primer dia).

Y ya para terminar, Tanto Clara (no trajo sus placas) como Mario (no pudo venir) deben observar por una semana más las placas en casa y si se aprecian colonias como las que se ven en las imágenes de recursos del blog, deben de contarlas en las placas (-4 y -3) y darnos el dato al resto.

Atentos al wassap, el correo y el Blog (en este orden o en el inverso).

Un saludo y Feliz Navidad.

Dr Francisco Martinez-Abarca
Estacion Experimental del Zaidin - CSIC
Department of Microbiology
C/ Profesor Albareda n 1
18008 Granada. Spain